如何使用CIRI识别环状RNA

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在最初的环状RNA研究中，认为环状RNA都是由exon通过反向剪切构成的,称之为exonic circRNA，只有这样的环状RNA能够由PCR反应验证出来的。

CIRI是一款环状RNA检测软件，通过该软件的预测结果，学者第一次用实验验证出了intronic circRNA和intergenic circRNA。该软件操作简便，准确度高，是非常流行的一款环状RNA检测软件。

该软件至少需要两个输入文件，基因组的fasta序列和测序数据比对产生的sam文件，需要注意的是，输入的sam文件必须是由bwa-mem算法比对产生的 。分析的pipeline示意如下

对于输入的sam文件，需要经过两次扫描，在第一次扫描时，根据双端数据的比对情况筛选候选的环状RNA，这一步通过判断SAM文件中CIGAR那一列的值来实现，本质上是检测覆盖环状RNA连接点处的junction reads,根据测序读长和连接点处包含的基因组区域的特征，分成以下3种模型

图A表示junction read只覆盖了起始外显子和终止外显子的部分序列，这两部分reads在基因组上的比对位置是相反的，绝大部分的环状RNA都符合这种模型。

图B表示junction read除了覆盖了起始外显子和终止外显子的两部分序列外，还覆盖了中间的一个外显子的部分序列，这种情况下reads可以分成3个部分比对到基因组上。

图C表示junction read除了覆盖了整个环状RNA外，还重复又读了一部分序列，这个只有当环状RNA的序列长度小于测序读长时才可能出现。

该软件将以上3种模型定义为paired chiastic clipping signals，简称PCC信号，如果一条reads比对情况符合以上任意一种，就认为该reads是一条环状RNA的junction reads。

为了提高准确性，识别到junciton reads之后，还会结合双端序列比对的质量paired end mapping即PEM和GT-AG保守的剪切位点进行过滤，示意图如下

只保留比对质量较高，且头尾符合AG-GT剪切信号的junciton reads进入下游分析，在第二次扫描SAM文件的过程中，通过动态规划算法给出最终的环状RNA预测结果，如果提供了GTF文件，还会对环状RNA进行注释。

该软件的使用步骤如下

1. bwa比对参考基因组

代码如下

bwa mem \
-T 19 \
-t 5 hg19_index \
R1.fastq.gz R2.fastq.gz \
> align.sam

2. 运行CIRI

CIRI2.pl  \
-T 20 \
-F hg19.fa \
-A hg19.gtf \
-I align.sam \
-O circRNA.xls

输出结果如下所示

在后续验证时，可以挑选表达量较高的来验证，在软件对应的文章中，挑选了junction reads数大于5的环状RNA来进行验证。

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